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sgRNA设计常见问题

日期:2019年4月10日 09:58

1. sgRNA设计在CDS区还是选取第一个或第二个外显子区域?

答:(1)尽量选择靶向所有转录本共用的外显子区域设计sgRNA。因为真核生物的基因包含外显子和内含子,利用这些内含子和外显子,一个基因可以剪接出多个转录本,翻译后得到多个蛋白。设计条件性敲除的时候,首先要搞清楚这个基因有几个转录本,一般敲除所有转录本共用的外显子。(2)优先选择在基因的第一或第二外显子区域设计sgRNA,以提高基因敲除效率。

2. 有哪些sgRNA免费设计的网站或软件可以使用?

答:(1)https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/
(2)http://chopchop.cbu.uib.no/
(3)http://crispor.tefor.net/
(4)http://www.rgenome.net/cas-designer/
(5)http://zifit.partners.org/ZiFiT/
(6)http://grna.ctegd.uga.edu
(7)http://www.e-crisp.org/E-CRISP/

3. 设计合成的sgRNA需要包含PAM序列吗?

答:CRISPR序列是一个DNA序列(不包括PAM),在使用软件设计CRISPR序列时,需要将目标DNA序列(包括假定的PAM序列)都输入,如果没有PAM,就不可能设计出CRISPR序列。
sgRNA是RNA形式的分子,sgRNA引导Cas9靶向识别CRISPR序列,其中的PAM位点作为CRISPR序列在基因组上的一个标记,对Cas9靶向识别目的序列至关重要,Cas9的两个核酸内切酶结构域将PAM前的3-4核苷酸间的3'-5’磷酸二酯键切断,对目的基因进行编辑。合成的sgRNA中不包括PAM序列。

4. 选择sgRNA是按照软件中评分由高到低考虑吗?

答:有些设计网站的评分是依据研究论文,但在数据样本量不是太大的情况下,并不能代表在真实细胞株中的sgRNA活性,所以效率评分仅能作为参考。选择crispr时,不能在基因组中存在明显的脱靶位置的序列。
原则上是优选那些脱靶几率低的sgRNA,判断目标序列与候选脱靶序列的相似性,尽可能选那些候选脱靶序列具3个mismatch的,然后再参考评分由高到低进行选择。

5. CRISPR序列是不是一定要加G、A或GG?

答:由于转录转录起始位点一边是以嘌呤开始(主要是G,有时为A),所以CRISPR序列一般以G开头。如果crispr(20nt)序列的前2 nt是GG,在以T7启动子(前17 nt)为驱动的体外转录中,当然是最好。如果crispr(20 nt)不是以G开头,可以加1-2个G,多了1-2G的sgRNA被证明不影响spCas9识别crispr序列的活性,但不能有效引导espCas9(保真版Cas9)识别crispr序列。

6. 在同一个基因上设计2个sgRNA,这两个sgRNA距离多远合适?

答:如果实验目的是希望敲除这个基因,两个sgRNA之间的距离越近越好,距离最长不要超过 200 bp。如果是希望在一个基因上制造出两个Indel突变位点,则建议相距200 bp之外,越远越好。

7. 如果做RT-PCR验证,引物是不是需要特异性针对设计sgRNA对应的转录本?

答:是的,需要设计特异性引物将靶向突变位置的cDNA扩增出来。由于基因组上基因组序列的改变可能会影响原始mRNA的剪接,因此设计引物时,最好是在目标序列的前面和后面的外显子上分别设计正反向引物。

8. 是通过测序结果比对sgRNA附近的位点是否出现突变,来判断基因编辑结果吗?

答:DNA双链断裂一般出现在PAM位点前的3-4 bp之间。非同源重组修复也发生在此位置的附近,当然也会有较大片段删除的情况出现。

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