关键字: 站内搜索:

您现在的位置:首页 >> 技术支持 >> 常见问题 >> AAV病毒包装及使用的常见问题

AAV病毒包装及使用的常见问题

日期:2019年2月21日 19:45

1,如果我的实验中需要将AAV注射入动物体内,如果贵公司提供的纯化产品比较浓,需要如何稀释病毒产品,有特殊要求吗?

答: 在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求,常规的动物试验用等渗溶液即可,如PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完,在没有保护剂的情况下,AAV在2~8℃保存时间越短越好。

2,我收到的AAV后该怎么处理,需要如何保存病毒产品?

答:一般我们提供的AAV保存在观梓特制的病毒保存液中(GenEasyTM病毒稀释保存液,货号:GZ19003),并存放于干冰中进行运输,您收到快递后,第一时间检查外包装有否破损,干冰是否挥发完,病毒产品是否已经解冻(如有以上情况发生,请第一时间联系我们进行处理)。
  当您收到病毒后在很短时间内即使用病毒进行实验,可以将病毒暂时放置于4℃保存;如需长期保存请放置于-80℃。第一次使用时根据每次用量进行分装,避免反复冻存。如您需要稀释冻存,请使用观梓GenEasyTM病毒稀释保存液,能够有效减少反复冻融及长期保存导致的滴度下降。

3,如何才能用AAV病毒在动物体内做出满意的结果?

答:病毒载体在动物试验中要想取得满意的结果,主要注意以下几个方面:
①选择适当的血清型:例如不同的AAV血清型在动物体内同一组织有不同的转导效率,如AAV1在肌肉组织中、AAV5在肺组织中有很高的转导效率。
②选择适当的靶器官:同一血清型AAV在不同的组织具有不同的转导效率,尽量选择转导效率高的靶器官。
③转导途径:尽量选择局部直接多点注射靶器官。
④转导病毒量:根据我们的经验,所加病毒量太多表达量反而会降低。
⑤检测时间:根据我们的经验不同基因的表达高峰时间是不同的,一般在2周可检测到基因表达,如无抗体产生的影响,基因的表达可持续表达半年以上的时间。

4,据说AAV在细胞上的表达远比不上在动物体内的表达,为什么?

答:AAV载体在体外实验中用于转导培养细胞时,常发现其表达水平较低,而且有表达延迟现象。这是因为AAV基因组是单链的,它进入细胞以后,必须要有一个由单链变为双链的过程,然后其所携带的外源基因才能进行转录和翻译,在没有辅助病毒或其它辅助因子的情况下,这种AAV由单链DNA在细胞内复制形成双链DNA的过程是十分缓慢的,因此相对于其它双链DNA病毒载体如单纯疱疹病毒(HSV)和腺病毒(Ad),其表达明显延后。此外,AAV对细胞毒性低,培养的细胞在加入AAV后,细胞分裂生长能力不受太大的影响,这样也对AAV载体有一种稀释作用,也导致其表观表达水平较低。而在体内应用时,注射部位的组织细胞通常没有显著增殖,不会出现AAV载体被稀释的情况,而且在体内各种促进AAV载体所携带外源基因表达的各种因子相对丰富,故体内应用时,AAV载体的表达水平比较高。

5,我的试验需要多少总量的AAV载体?

答:AAV介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分。
  对于杭州观梓制备和提供的rAAV病毒而言,通常AAV病毒颗粒数与受试细胞数的比例大于104 v.p./cell才能检测到外源基因的表达,达到105~106 v.p./cell才能获得较理想的表达水平。然而,也不是比例越高越好,当比例大于107时,外源基因的表达水平反而会明显下降,甚至几乎检测不到表达。其机理尚不清楚,这可能与AAV病毒具有多个细胞受体有关,比如已知道AAV2病毒就有3个细胞受体。
  根据我们的经验,一般AAV动物实验低、中、高剂量组用药量分别为1011、1012、1013v.p./kg左右。 

6,腺相关病毒载体是不是只要能转入细胞就可以整合到宿主细胞基因组中?如果不是,那么整合率大概有多少?是不是跟靶细胞类型有关呢?

答:野生型AAV病毒感染细胞后倾向于整合到19号染色体的AAVS1位点。这个特性是与其rep基因功能和ITR结构以及染色体特定位置的序列相关的。重组AAV载体是经过改造的,已经去除了其rep和cap基因,因此已经失去了特异整合的特性。对于不同的靶细胞,AAV载体的整合几率是不同的。越来越多的研究发现,在许多组织中AAV载体进入细胞后并不整合,而以附加子(episome)形式存在,最为典型的是在肌肉中。也有些研究报道AAV载体的整合是相对随机的,有整合到活跃的基因中的倾向。

7,AAV病毒载体对目的基因的长度是否有要求?

答:AAV的总包装容量是4.7 kb,载体中两个ITR共290 bp,因此实际可以插入的序列长度[一般包含启动子+目的基因+报告基因(可选)+ polyA]不超过4.4kb。我们以最常规的CMV启动子,不使用报告基因为例:hCMV(约750 bp)+polyA(约150 bp)约900bp,如果用AAV包装载体,目的基因长度要求不超过3.5 kb。

所属类别: 常见问题

该资讯的关键词为: