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借助hPSCs定点敲入模型发现促进hPSCs肝向分化的关键因子

日期:2018年8月3日 21:59

2018年5月31日,本公司创始人之一,中国科学院上海营养与健康研究院丁秋蓉教授在国际学术期刊Stem Cell Reports上在线发表题为“Genetic and chemical screenings identify HDAC3 as a key regulator in hepatic differentiation of human pluripotent stem cells”的研究论文,运用CRISPR-Cas9-based的全基因组敲除技术,揭示了包括组蛋白去乙酰化酶HDAC3在内的多个调控因子在肝细胞分化中的重要作用。

借助hPSCs定点敲入模型发现促进hPSCs肝向分化的关键因子

 

中国是肝脏疾病高发的国家,病毒性肝炎尤其是乙肝发病率更是高居不下。通过人多能干细胞hPSCs体外定向分化为肝脏样细胞(hepatocyte like cells, HLCs),有助于肝脏疾病的模拟、毒理检测以及提供肝脏移植供体。但目前得到的HLCs普遍存在成熟度不够、纯度不够的问题,限制了其在基础科学和转化医学方面的应用。

论文首先利用CRISPR技术在肝脏成熟标志物白蛋白(ALB)终止密码子前定点敲入绿色荧光蛋白(Venus)表达框,结合piggyBac转座技术删除抗性筛选基因,由此建立成熟肝脏谱系标记的人多能干细胞报告株。在此基础上,运用GeCKO文库进行全基因组筛选,结合深度测序,鉴定出ATG7,RPS6KA2, HDAC3等多个参与调节人多能干细胞体外肝向分化的基因。

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成熟肝脏谱系标记的人多能干细胞报告株的建立

借助hPSCs定点敲入模型发现促进hPSCs肝向分化的关键因子

GeCKO全基因组文库筛选

进一步针对43个表观遗传调控因子进行了靶向小分子化合物文库筛选,发现CI-994(组蛋白去乙酰化酶小分子抑制剂)能显著促进HLCs的定向分化,且效果优于HDAC3基因敲除,这佐证了基因文库筛选的结果,同时暗示HDAC1/2可能同样参与调节肝细胞分化。另一方面,研究表明CI-994有助于维持体外培养过程中原代肝脏细胞的肝脏属性。

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靶向小分子化合物文库筛选

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小分子抑制剂CI-994促进HLCs的定向分化

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小分子抑制剂CI-994上调原代肝细胞成熟标志物的表达

论文最后,对HDAC3调节肝细胞分化的机制进行了研究,发现HDAC3可以与肝脏谱系关键转录因子HNF4等结合共同调节肝脏细胞分化过程。

借助hPSCs定点敲入模型发现促进hPSCs肝向分化的关键因子

HDAC3与HNF4共同调节ALB蛋白的表达

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